免疫沉淀操作详细步骤

免疫沉淀操作详细步骤

 1．主要内容
    确定抗原的存在、质量、大小、转换、修饰及相关性。
    多个步骤共需1/2—1天。
    半定量到定量。
    敏感性取决于抗原的相对质量及抗体的亲和力。
需要高亲和力的抗体。
 
    2．操作步骤
    (1)每1．0ml抗原溶液中加入50pl正常兔血清。
    (2)冰上孵育1h。
    (3)在孵育的同时，另将SAC在裂解缓冲液中清洗1次。每50u1正常兔血清使用100,ul包装好的SAC。以10 000g，30s离心SAC，用巴斯德移液管研磨使SAC再悬浮。10000g再次离心，移去洗液，将洗好的SAC微球置于冰上。
    (4)孵育1 h后，用裂解产物再悬浮SAC微球。
    (5)冰上孵育30min。
    (6)4C，10000g，离心15rain，移去上清液储存。
    (7)将上清分装入数个1．5 m1的管中。在不同的管中加入免疫血清或对照血清(杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水)。其他体积要与抗体量、抗原量的特殊处理相适应。
    (8)冰上孵育1min。
    (9)针对抗体—抗原反应，加入蛋白A还是蛋白G微球取决于所使用的抗体类型(见下表)，加入100ml含有10％微球的裂解缓冲液(zui后微球体积为10 m1)，密封，4C摇床孵育1h。
    (10)10000g，15s，413，离心收集微球，用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次，用23号针吸取裂解物和洗液。
    (11)尽可能移去zui后的洗液。
    (12)将免疫复合物进行分析，通常采用SDS-PAGE电泳。